強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種主要累及骶髂關(guān)節(jié)、脊柱及外周關(guān)節(jié)的慢性風(fēng)濕性疾病，其特征性的病理進(jìn)程包括關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性侵蝕和融合，最終導(dǎo)致脊柱與關(guān)節(jié)的強(qiáng)直畸形，成為患者致殘的主因。AS患者同時(shí)存在局部新骨形成和系統(tǒng)性骨丟失的復(fù)雜現(xiàn)象，這可能是由于局部破骨功能受損。作為破骨細(xì)胞前體(OCP)，外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)在AS患者中表現(xiàn)出了較弱的破骨細(xì)胞生成能力，且與病程負(fù)相關(guān)，表明PBMCs向破骨細(xì)胞譜系分化的障礙可能參與AS病變，對(duì)炎癥性骨生成具有潛在治療意義。

本研究對(duì)健康供體及不同時(shí)期AS患者的PBMCs進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，揭示了單核細(xì)胞重新聚集后OCP發(fā)育模式及其在AS發(fā)病和不同預(yù)后階段的改變。核糖體合成，尤其是其代表性分子RPS17，對(duì)單核細(xì)胞向具有OCP特征的狀態(tài)演化至關(guān)重要。在AS的發(fā)病和進(jìn)展過(guò)程中，RPS17依賴(lài)的核糖體合成呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這種功能減弱參與了AS的炎癥性骨形成和關(guān)節(jié)強(qiáng)直性破壞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，條件性敲除RPS17可改善卵巢切除(OVX)誘導(dǎo)的骨丟失并增強(qiáng)破骨細(xì)胞生成，而過(guò)表達(dá)RPS17能改善AS樣小鼠的關(guān)節(jié)病變，局部注射過(guò)表達(dá)RPS17的單核源性O(shè)CP則在避免促進(jìn)骨丟失的同時(shí)，顯著緩解了關(guān)節(jié)異常，表明其具有預(yù)防和治療AS外周病變的潛力，其機(jī)制與增強(qiáng)關(guān)節(jié)表面破骨細(xì)胞生成及OCP的T細(xì)胞抑制功能相關(guān)。

1.單核細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析

為表征AS患者的單核細(xì)胞免疫特征，對(duì)14例患者和3例健康供體(HDs)的PBMCs進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)。將AS患者分為三組：未經(jīng)治療的高活動(dòng)度初診患者(EAs)、出現(xiàn)脊柱畸形或外周關(guān)節(jié)破壞的晚期患者(LDs)，以及經(jīng)規(guī)范化治療后達(dá)到臨床緩解的患者(RMs)。通過(guò)UMAP聚類(lèi)分析共鑒定出23個(gè)細(xì)胞簇，依據(jù)基因表達(dá)特征將簇2、3、6、10、16定義為單核細(xì)胞并進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組整合分析。對(duì)重新聚類(lèi)后的38,654個(gè)單核細(xì)胞進(jìn)一步劃分為11個(gè)亞群，根據(jù)CD14/CD16表達(dá)狀態(tài)，亞群-0/1/2/5/9被注釋為經(jīng)典單核細(xì)胞(C monos；CD14^brightCD16^dim)，亞群-3/10被注釋為非經(jīng)典單核細(xì)胞(N monos；CD14^dimCD16^bright)，亞群-4/6/8被注釋為中間型單核細(xì)胞(Inter monos；CD14^brightCD16^bright)，而亞群-7由于缺乏CD14和CD16，被注釋為CD14^dimCD16^dim單核細(xì)胞。在EAs中，C monos的比例高于HDs，功能富集分析顯示，CD14^dimCD16^dim單核細(xì)胞更多參與多核破骨細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞融合及黏膜固有免疫應(yīng)答。

2.不同單核細(xì)胞類(lèi)型的破骨細(xì)胞生成潛能

對(duì)不同單核細(xì)胞亞型的破骨細(xì)胞生成潛能進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，CD16^?的單核細(xì)胞展現(xiàn)出的破骨細(xì)胞生成能力，形成的破骨細(xì)胞數(shù)量最多，且高表達(dá)破骨細(xì)胞相關(guān)蛋白(如CTSK、MMP9、TRAP和NFATC1等)，其中CD14^brightCD16^?細(xì)胞的生成能力強(qiáng)。CD16⁺的單核細(xì)胞(包括N monos和Inter monos)的破骨細(xì)胞生成能力則相對(duì)較低。CD14^dimCD16^dim單核細(xì)胞由于其多能性，尤其是在細(xì)胞融合和多核化方面的優(yōu)勢(shì)，因此具備顯著的破骨細(xì)胞分化潛力，細(xì)胞軌跡分析也支持其在發(fā)育早期具有多能性特征。

3.AS的特征是單核細(xì)胞向OCP譜系分化的減少

細(xì)胞從早期狀態(tài)(state-1，主要為CD14^dimCD16^dim單核細(xì)胞)經(jīng)state-3，向高破骨細(xì)胞生成潛能的終末狀態(tài)(state-4/5)發(fā)展。但在AS患者中，代表早期階段的state-2細(xì)胞增多，而代表成熟OCP的state-4/5細(xì)胞減少，同時(shí)伴隨早期分子標(biāo)記(如MT-ND6、NAMPT)表達(dá)上升，而OCP相關(guān)標(biāo)記(如CSTA、CFD)表達(dá)下降，這共同導(dǎo)致了外周破骨細(xì)胞生成減少。機(jī)制上，該發(fā)育軌跡受兩個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程驅(qū)動(dòng)：在1-3階段，核糖體合成是推動(dòng)OCP早期發(fā)育的核心因素(涉及RPLP1、RPL13、RPS12、RPS28等分子)；在3-4階段，宿主防御與炎癥反應(yīng)(涉及CD14、S100A8/A9/A12等分子)進(jìn)一步促進(jìn)其向成熟OCP發(fā)展。核糖體分子在誘導(dǎo)過(guò)程中的表達(dá)上調(diào)以及其敲低實(shí)驗(yàn)抑制破骨細(xì)胞生成的結(jié)果，揭示了核糖體合成對(duì)OCP發(fā)育的必要貢獻(xiàn)，以及宿主防御反應(yīng)在此過(guò)程中的關(guān)鍵作用。

4.AS患者單核細(xì)胞外周血中RPS17表達(dá)降低

AS患者單核細(xì)胞的核糖體合成功能減弱，翻譯下調(diào)基因增多，進(jìn)而導(dǎo)致AS相關(guān)OCP發(fā)育受損。其中關(guān)鍵分子CD14與RPS17的表達(dá)水平從HDs到AS患者逐漸下降，RPS17的低表達(dá)導(dǎo)致破骨細(xì)胞生成不足，無(wú)法有效吸收新生骨，從而參與AS異常骨形成和關(guān)節(jié)病理改變。功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)RPS17能增強(qiáng)并恢復(fù)破骨細(xì)胞分化能力，且該作用獨(dú)立于RANK等經(jīng)典破骨調(diào)控通路，表明RPS17通過(guò)維持核糖體合成特異性調(diào)控破骨細(xì)胞發(fā)育，其表達(dá)不足是AS骨代謝失衡的重要原因。

5.RPS17-CKO可改善破骨細(xì)胞生成性骨丟失

RPS17條件性敲除(RPS17-CKO)能夠顯著改善OVX誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松性骨丟失。在不影響OVX小鼠正常生理表型的情況下，能顯著減輕小鼠骨丟失和骨小梁損傷；骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb. Th)和數(shù)量(Tb. N)等骨質(zhì)量參數(shù)增加，以及骨小梁分離度(Tb. Sp)的降低，減少了骨小梁結(jié)構(gòu)的破壞。RPS17-CKO部分阻斷了OVX小鼠骨小梁面積(Tb. Ar)的減少，降低了破骨細(xì)胞的異常增多。此外，敲除RPS17的OCP分化能力急劇下降，進(jìn)一步證實(shí)了RPS17是促進(jìn)破骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵分子，靶向抑制RPS17能夠有效抑制破骨細(xì)胞生成，從而緩解骨吸收亢進(jìn)導(dǎo)致的骨丟失，因此RPS17可能為治療以過(guò)度骨吸收為特征的疾病(如骨質(zhì)疏松)提供新的策略。

6.RPS17過(guò)表達(dá)可緩解AS模型小鼠的表型

通過(guò)構(gòu)建AS模型小鼠并關(guān)節(jié)內(nèi)注射特異性過(guò)表達(dá)RPS17的腺相關(guān)病毒(CD11b-promoter-RPS17-AAVs)，驗(yàn)證了RPS17在AS病變中的關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)該病毒能有效靶向遞送至關(guān)節(jié)區(qū)域RANK⁺的OCPs。在AS模型小鼠中，雖然RANK表達(dá)普遍增強(qiáng)，但RPS17表達(dá)顯著降低，而RPS17過(guò)表達(dá)治療后兩者熒光信號(hào)均有增強(qiáng)，成功在動(dòng)物水平復(fù)現(xiàn)了患者病理特征。治療顯著改善了小鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹程度和關(guān)節(jié)炎評(píng)分，關(guān)節(jié)退變、骨贅形成及新生骨量也得到緩解，同時(shí)破骨細(xì)胞數(shù)量增加。這些結(jié)果證明，通過(guò)病毒靶向過(guò)表達(dá)RPS17能有效促進(jìn)破骨細(xì)胞生成、增強(qiáng)骨吸收能力，從而減輕AS相關(guān)的異常骨形成和關(guān)節(jié)破壞，進(jìn)一步確立了RPS17介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成在緩解AS病變中的直接因果關(guān)系和治療潛力。

7.RPS17過(guò)表達(dá)單核細(xì)胞源性O(shè)CPs在AS樣病變中的治療價(jià)值

考慮到全身性過(guò)表達(dá)RPS17可能加劇骨丟失的風(fēng)險(xiǎn)，本研究探索了一種更安全有效的細(xì)胞治療策略。利用RPS17過(guò)表達(dá)的人單核源OCPs進(jìn)行治療，這些細(xì)胞不僅高表達(dá)髓源性抑制細(xì)胞(M-MDSC)標(biāo)志物(CD11b、CD33和SPARC)并有效抑制T細(xì)胞增殖，具備抗關(guān)節(jié)免疫炎癥的潛力，而且能靶向遞送至關(guān)節(jié)表面的鄰近骨組織，增強(qiáng)局部破骨細(xì)胞生成以吸收異常新生骨，同時(shí)避免在軟骨下骨中過(guò)度激活破骨細(xì)胞。與直接注射RPS17過(guò)表達(dá)病毒(AAVs)會(huì)導(dǎo)致全身骨量減少不同，細(xì)胞治療能顯著改善AS模型小鼠的關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)炎評(píng)分、關(guān)節(jié)退變及骨贅形成，且不引起明顯的骨丟失或移植物抗宿主病等不良反應(yīng)。這些結(jié)果表明，基于RPS17過(guò)表達(dá)OCPs的細(xì)胞療法既能通過(guò)“局部破骨增強(qiáng)"和“免疫抑制"雙重機(jī)制有效緩解AS樣關(guān)節(jié)病變，又具有更高的安全性，凸顯了基因修飾對(duì)細(xì)胞治療效果的提升價(jià)值。

這項(xiàng)研究系統(tǒng)闡述了AS患者外周血中OCP發(fā)育異常的機(jī)制，指出核糖體合成功能障礙是導(dǎo)致OCP向成熟破骨細(xì)胞分化受阻的關(guān)鍵原因。研究人員通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，AS患者體內(nèi)單核細(xì)胞向OCP譜系分化的軌跡中，核糖體蛋白R(shí)PS17的表達(dá)顯著下降，且其降低程度與疾病進(jìn)展相關(guān)，這直接削弱了骨吸收能力，導(dǎo)致關(guān)節(jié)部位異常新骨形成和強(qiáng)直性破壞。研究進(jìn)一步驗(yàn)證了RPS17在調(diào)控破骨細(xì)胞生成中的核心作用，并創(chuàng)新性地提出通過(guò)局部注射RPS17過(guò)表達(dá)的單核OCP進(jìn)行細(xì)胞治療，能在不引起全身性骨丟失的前提下，有效改善AS模型小鼠的關(guān)節(jié)炎癥和骨贅形成，為AS的靶向治療提供了新策略。